凝膠遷移（EMSA）的轉(zhuǎn)膜和紫外交聯(lián)步驟

作者：上海峰志時(shí)間：2022-10-28 22:08:56瀏覽3441 次

信息摘要：

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

EMSA技術(shù)是基于DNA/蛋白質(zhì)或RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理。首先讓蛋白質(zhì)與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合，然后在跑PAGE膠，結(jié)合了蛋白質(zhì)的復(fù)合物比未結(jié)合蛋白質(zhì)的探針電泳的速度要慢，這樣，從PAGE膠的電泳結(jié)果就可以判斷，該蛋白是否和特定序列結(jié)合或者該序列是否和蛋白結(jié)合。

EMSA轉(zhuǎn)膜的步驟：

a. 取一和EMSA膠大小相近或略大的尼龍膜，剪角做好標(biāo)記，用0.5XTBE浸泡至少10分鐘。尼龍膜自始至終僅能使用鑷子夾取，并且僅可夾取不可能接觸樣品的邊角處。

b. 取兩片和尼龍膜大小相近或略大的濾紙，用0.5XTBE浸濕。

c. 把浸泡過(guò)的尼龍膜放置在一片浸濕的濾紙上，注意避免尼龍膜和濾紙間產(chǎn)生氣泡。

d. 非常小心地取出EMSA膠放置到尼龍膜上，注意確保膠和膜之間沒有氣泡。

e. 再把另外一片浸濕的濾紙放置到EMSA膠上，注意確保濾紙和膠之間沒有氣泡。

f. 采用Western時(shí)所使用的濕法電轉(zhuǎn)膜裝置或其它類似的電轉(zhuǎn)膜裝置，以0.5XTBE為轉(zhuǎn)膜液，把EMSA膠上的探針、蛋白以及探針和蛋白的復(fù)合物等轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。對(duì)于大小約為10x8x0.1cm的EMSA膠，用BioRad的常用的Western轉(zhuǎn)膜裝置，電轉(zhuǎn)時(shí)可以設(shè)置為380mA(約100V)轉(zhuǎn)膜30-60分鐘。如果膠較厚，則需適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間。轉(zhuǎn)膜時(shí)需保持轉(zhuǎn)膜液的溫度較低，通?？梢园央娹D(zhuǎn)槽置于4C冷庫(kù)或置于冰浴或冰水浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，這樣可以確保低溫。具體的電轉(zhuǎn)膜方法請(qǐng)參考電轉(zhuǎn)膜裝置的使用說(shuō)明。

g. 轉(zhuǎn)膜完畢后，小心取出尼龍膜，樣品面向上，放置在一干燥的濾紙上，輕輕吸掉下表面明顯的液體。立即進(jìn)入下一步的交聯(lián)步驟，不可使膜干掉。

紫外交聯(lián)的步驟：

a. 用紫外交聯(lián)儀(UV crosslinker UCL-3500)選擇254nm紫外波長(zhǎng)，120mJ/cm2，交聯(lián)25-60秒(根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，建議交聯(lián)30秒)。如果沒有紫外交聯(lián)儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如美國(guó)路陽(yáng)的手提紫外檢測(cè)儀LEC-280)，距離膜5-10厘米左右照射3-10分鐘。也可以使用超凈工作臺(tái)內(nèi)的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射3-15分鐘。

b. 紫外交聯(lián)完畢后，可以直接進(jìn)入下一步檢測(cè)；也可以用保鮮膜包裹后在室溫干燥處存放3-5天，然后再進(jìn)入下一步檢測(cè)。

c. 如果檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)交聯(lián)效果不佳，甚至連free probe的條帶都非常微弱，可以考慮在膜干燥后參考步驟A的條件再交聯(lián)一次，以進(jìn)一步改善交聯(lián)效果。