如何用組織研磨儀提取RNA

組織研磨儀破碎肌肉組織提取RNA

通過大量樣品破碎測試發(fā)現(xiàn)，動物組織樣品相比其他樣品更難破碎，特別是一些內(nèi)臟組織、結(jié)締組織、心臟肌肉組織、肺部組織，一般很難用手工或者常規(guī)組織勻漿儀徹底破碎。因為這些動物組織樣品一般韌性較大，如果使用手工研磨或者組織勻漿儀，不僅一次處理量太少、易污染且難清洗，處理后的樣品還不夠均勻細致，達不到后續(xù)提取RNA等實驗的要求。組織研磨儀研磨內(nèi)臟及腫瘤細胞，后續(xù)提取RNA，實驗順利，效果很好，以下是研磨實驗的主要流程，可供相關(guān)實驗人員參考：

研磨材料準備：
·樣品種類：人體腫瘤細胞、胰腺、前列腺、脂肪、肌肉，每個組織各研磨2個樣品，用液氮處理保存。
·研磨配件種類：組織研磨儀2.0ml研磨管適配器（28×2.0ml）1對，6mm不銹鋼研磨珠若干顆。

研磨實驗流程：
1. 高溫滅菌預(yù)處理6mm不銹鋼研磨珠；
2. 將滅菌處理過的研磨珠與研磨管適配器置入液氮中同時進行預(yù)冷處理；
3. 將樣品從液氮中取出，在研缽中切割成約4-5mm寬的樣品小塊。
4. 在2ml無菌圓底離心管(進口)中依次加入：預(yù)冷6mm研磨鋼珠1顆、切好的樣品塊1塊、預(yù)冷6mm研磨鋼珠1顆。
5. 確保離心管中有2顆6mm研磨鋼珠和1塊樣品塊后，快速蓋好管蓋，對稱放入預(yù)冷的2.0ml研磨管適配器孔槽中。
6. 將適配器固定在TL2020組織研磨破碎儀的兩個搖臂上，設(shè)置轉(zhuǎn)速1800rpm，時間120S（胰腺樣品180S），一鍵開始研磨。
8. 研磨時間結(jié)束，卸載適配器取出離心管，在管中快速加入裂解液，然后按照后續(xù)RNA提取實驗步驟操作。

研磨效果：
·后續(xù)成功提取RNA，且電泳圖條帶清晰可見。

本實驗中，使用組織研磨儀一次性高速破碎56個2ml的內(nèi)臟樣品組織，不僅操作靈活方便，還能安全輕松地進行液氮冷凍研磨操作，保證了RNA提取等溫度敏感性后續(xù)實驗的順利進行。此外，用組織研磨儀進行類似的動物樣品組織研磨，避免了樣品間的交叉污染，省去了清洗儀器的繁瑣工作，對于樣品量巨大且需要無菌操作的實驗，無疑大大提高了效率。

組織研磨儀研磨動物組織提取RNA

在制作動物皮膚組織樣品的時候，會發(fā)現(xiàn)皮膚組織韌性特別高。皮膚富含纖維組織和彈性，要從這類組織有效提取RNA是非常困難的，因此完全研磨這些組織是十分具有挑戰(zhàn)性的。傳統(tǒng)的人工或用手持式勻漿器來研磨不僅費時，研磨后的效果也不盡人意比較差，RNA產(chǎn)量低且令樣本發(fā)熱,那么使用組織研磨儀會有什么不同的效果呢？

大、小鼠皮膚組織提取DNA、RNA是目前各高校實驗室的一項難題。本次實驗對象為小鼠去毛后處理過的皮膚，要求磨細一點，提高RNA的濃度，涉及到RNA提取還需要低溫研磨，因為有提取液，所以溫度不能太低，否則凍住液體無法研磨，

實驗步驟：
1、準備金屬適配器一套，離心管和研磨珠若干。
2、預(yù)冷模塊，把金屬適配器放到液氮或冰箱中預(yù)冷（不用的時候順手把模塊放入-20冰箱，即可省去預(yù)冷步驟）
3、取適量小鼠皮膚組織、研磨珠、提取液一起放入離心管中，每管加三到五顆研磨珠，蓋子蓋上。
4、將完成預(yù)冷后的金屬模塊取出，放入研磨儀中固定（適配器底部與軸的卡槽互相卡牢）放平后將離心管分別放入適配器對應(yīng)孔位，（注意平面配平，對稱放樣）蓋上適配器蓋，旋緊螺帽。
5、設(shè)置好參數(shù)（根據(jù)組織類型以及量微調(diào)），開始研磨。
6、磨好后打開儀器取出離心管，即可進行后續(xù)實驗。

注意事項：

1、按照組織的種類和量來選擇研磨珠能達到zui好的效果，有不清楚的及時問上海凈信銷售人員。
2、往金屬適配器里放離心管時注意平面配平，保證適配器壓蓋在水平線上。

實驗選用儀器： 全自動樣品快速研磨儀
與目前已有的其它樣品制備方法相比，具有通用性廣、高效靈活的優(yōu)點。該系統(tǒng)避免了研磨、勻漿、超聲波處理等傳統(tǒng)方法的費力、耗時、低效等諸多缺點，可以高效、快速、穩(wěn)定地裂解并純化各種類型樣品的核酸與蛋白。

組織研磨儀快速提取雞肉組織中的RNA實驗步驟

一、實驗?zāi)康模嚎焖偬崛游锝M織中的總RNA
二、實驗器材及試劑：研磨儀，離心管，移液槍，電泳槽、凝膠成像等；無水乙醇，液氮，瓊脂糖。
三、實驗材料：雞肉組織。
四、實驗步驟
1）雞肉組織
2）鮮組織用解剖刀迅速切成小碎離心管中，加入小號研磨珠，將管子蓋嚴后放入液氮中冷凍，設(shè)置參數(shù)，點擊運行即可開始研磨。
3）取適量組織細粉轉(zhuǎn)入裝有組織裂解液RLT的離心管中,用手劇烈振蕩若干秒，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性注射器抽打裂解物若干次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿若干秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
4）將勻漿后裂解物離心,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物,將裂解物上清小心轉(zhuǎn)到一個新離心管。
5）接操作步驟項下3。
6）較估計裂解物(上清)體積,加入等體積的乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!）,此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。
7）立刻將混合物加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）離心60秒，棄掉廢液。
8）加去蛋白液RW1，室溫放置幾秒，離心30秒，棄掉廢液。
9）如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置幾分鐘再離心。
10）加入漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），離心30秒，棄掉廢液。加入漂洗液RW,重復(fù)一遍。
11）將吸附柱RA放回空收集管中離心2分鐘，盡量除去漂洗液,以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
12）取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期全自動樣品快速研磨儀RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water，室溫放置1分鐘，離心1分鐘。
13）如果預(yù)期RNA產(chǎn)量>30μg,加30-50μl RNase free water重復(fù)步驟8,合并兩次洗脫液,或者使用次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。
14）洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據(jù)需要選擇。
五、實驗結(jié)果：
提取的雞肉組織RNA點樣量為1ul，雞肉組織RNA兩個條帶亮度相當(dāng)，提示出現(xiàn)降解。

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